動物源性食品中氯霉素類藥物

　　殘留量測定

　　1范圍

　　本標準規定了動物源性食品中氯霉素類殘留量的氣相色譜-質譜和液相色譜-質譜/質譜測定 方法。

　　本標準適用于水產品、畜禽產品和畜禽副產品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素殘留的定性確證和 定量測定。

　　2氣相色譜-質譜法

　　2. 1原理

　　樣品用乙酸乙酯提取,4%氯化鈉溶液和正己烷液-液分配凈化，再經弗羅里硅土(Florisil)柱凈化 后，以甲苯為反應介質，用N，0雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷(BSTFA + TMCS，" + 1) 于70 X：硅烷化，用氣相色譜/負化學電離源質譜測定，內標工作曲線法定量。

　　2.2試劑和材料

　　除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和二次去離子水或相當純度的水。

　　2.2.1甲醇：色譜純。

　　2.2.2甲苯:農殘級。

　　2.2.3正己烷:農殘級。

　　2.2.4乙酸乙酯。

　　2.2.5 乙醚。

　　2.2.6氯化鈉。

　　2. 2. 7氣霉素(CAP)、氟甲砜霉素(FF)、甲砜霉素(TAP)標準物質:純度>99%。

　　2. 2. 8間硝基氯霉素(m-CAP)標準物質:純度>99%。

　　2. 2. 9氯化鈉溶液(4%):稱取適量氣化鈉用水配置成4%的氣化鈉溶液，常溫保存，可使用1周。

　　2.2. 10氯霉素類標準儲備溶液：準確稱取適量氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素標準物質(精確到 0.1 mg)，以甲醇配制成濃度為1〇〇 Pg/mL的標準儲備溶液。

　　2.2.11間硝基氯霉素內標工作溶液:準確稱取適量間硝基氯霉素標準物質(精確到〇• 1 mg)，用甲醇 配制成1〇 ng/mL的標準工作溶液。

　　2.2. 12氯霉素類基質標準工作溶液:選擇不含氯霉素類的樣品六份，分別添加1 mL內標工作溶液 (2.2. 11),用這六份提取液分別配成氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素濃度為0-1 ng/mL、0.2 ng/mL、 1 ng/mL、2 ng/mL、4 ng/mL、8 ng/mL的溶液,按本方法提取(2. 4.1)、凈化(2. 4. 2)，制成樣品提取液， 用氮氣緩慢吹干，硅烷化(2. 4. 3)后，制成標準工作溶液。

　　2.2. 13衍生化試劑：N，0雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺-三甲基氯硅燒(BSTFA+TMCS，99+1)。 2.2.14固相萃取柱：弗羅里硅土柱(6.〇 mL，1.0 g)。

　　2.3儀器和設備

　　2.3. 1氣相色譜/質譜聯用儀:配有化學電離源(CI)。

　　2.3.2組織搗碎機。

　　2.3.3固相萃取裝置。

　　2.3.4振蕩器。

　　2.3.5旋轉蒸發儀。

　　2.3.6渦旋混合器。

　　2.3.7離心機。

　　2.3.8恒溫箱。

　　2.4測定步驟

　　2.4. 1提取

　　稱取10 g(精確到0. 01 g)粉碎的組織樣品于50 mL具塞離心管中，加人1. 〇 mL內標溶液 (2. 2. 11)和30 mL乙酸乙酯，振蕩30 min，于4 000 r/min離心2 min，上層清液轉移至圓底燒瓶中，殘 渣用30 mL乙酸乙酯再提取一次，合并提取液,35 °C旋轉蒸發至1 mL?2 mL，待凈化。

　　2.4.2 凈化

　　2.4.2. 1液-液萃取

　　提取液濃縮物(2.4. 1)加1 mL甲醇溶解，用20 mL氯化鈉溶液(2. 2. 9)和20 mL正己烷液-液萃 取，棄去正己烷層，水相用40 mL乙酸乙酯分兩次萃取，合并乙酸乙酯相于心形瓶中，35 旋轉蒸發至 近干，用氮氣緩慢吹干。

　　2. 4. 2. 2弗羅里硅土柱凈化

　　弗羅里硅土柱依次用5 mL甲醇、5 mL甲醇-乙醚(3 + 7)溶液和5 mL乙醚淋洗備用。將殘渣 (2.4.2.1)用5.0 mL乙醚溶解上樣，用5.0 mL乙醚淋洗Florisil柱，5.0 mL甲醇-乙醚溶液(3 + 7)洗 脫，洗脫液用氮氣緩慢吹干，待硅烷化。

　　2.4.3硅烷化

　　凈化后的試樣(2. 4. 2. 2)用0. 2 mL甲苯溶解，加入〇• 1 mL硅烷化試劑(2. 2. 13)混合，于70 X：衍

　　生化60 min。氮氣緩慢吹干，用1.0 mL正己烷定容，待測定。

　　2.4.4測定

　　2.4.4.1氣相色譜-質譜條件

　　a) 色譜柱:DB-5MS毛細管柱，30 mX0.25 mm (內徑)X0.25 /rni，或與之相當者;

　　b) 色譜柱溫度:50 t;保持1 min，25 t：/min升至280 保持5 min;

　　c) 進樣口溫度：250 t;

　　d) 進樣方式:不分流進樣，不分流時間〇. 75 min;

　　e) 載氣:高純氮氣，純度>99. 999%;

　　f) 流速：1. 0 mL/min;

　　g) 進樣量:l.〇nL;

　　h) 接口溫度JSOt：;

　　i) 離子源:化學電離源負離子模式NCI;

　　j) 掃描方式:選擇離子監測;

　　k) 離子源溫度：15〇X：;

　　l) 四級桿溫度：106X：;

　　m) 反應氣：甲烷，純度>99. 999%;

　　n) 選擇監測離子參見表1。

　2. 4. 4. 2定性測定

　　進行試樣測定時，如果檢出色譜峰的保留時間與標準物質相一致，并且在扣除背景后的樣品質譜圖 中，所選擇的離子均出現，而且所選擇離子的相對離子豐度比與標準物質一致，相對豐度允許偏差不超過表1規定的范圍，則可判斷樣品中存在對應的三種氯霉素。如果不能確證，應重新進樣，以掃描方式 (有足夠靈敏度)或采用增加其他確證離子的方式來確證。

　　2. 4. 4. 3內標工作曲線

　　用配制的基質標準工作溶液(2. 2.12)按2.4.4. 1的氣相色譜-質譜條件分別進樣，以標準溶液濃度 為橫坐標，待測組分與內標物的峰面積之比為縱坐標繪制內標工作曲線。

　　2. 4. 4. 4 定置

　　以mM66(m-CAP和CAP)、339(FF)和409(TAP)為定量離子，樣品溶液中氯霉素類衍生物的響應值均應在儀器測定的線性范圍內。在上述色譜條件下(2. 4. 4. 1)，m-CAP、CAP、FF、TAP標準物質 衍生物參考保留時間約為11. 4 min、ll. 8 min、12. 6 min、13. 6 min。氯霉素類標準物質衍生物總離子 流圖和質譜圖參見附錄A中的圖A. 1和圖A. 2。

　　2.4.5平行實驗

　　按以上步驟，對同一試樣進行平行試驗測定。

　　2.4.6空白實驗

　　除不加試樣外，均按上述測定步驟進行。

　　2.5結果計算

　　結果按式(1)計算：

　　X = .................. ( 1 )

　　式中：

　　X——試樣中被測組分殘留量，單位為微克每千克(Mg/kg); c——從內標標準工作曲線上得到的被測組分濃度，單位為納克每毫升(ng/mL);

　　V——試樣溶液定容體積，單位為毫升(mL); m——試樣的質量，單位為克(g)。

　　GB/T 22338—2008 2.6測定低限

　　氣相色譜-質譜測定低限為:氯霉素0.1 yg/kg，氟甲砜霉素和甲砜霉素〇.5 Mg/kg。

　　2.7回收率和精密度

　　參見附錄B。

　　3液相色譜-質譜/質譜法 3. 1原理

　　針對不同動物源性食品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留，分別采用乙腈、乙酸乙酯-乙醚或乙 酸乙酯提取，提取液用固相萃取柱進行凈化，液相色譜-質譜/質譜儀測定，氯霉素采用內標法定量，甲砜霉素和氟甲砜霉素采用外標法定量。

　　3.2試劑和材料

　　除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和二次去離子水或相當純度的水。

　　3.2. 1甲醇:液相色譜級。

　　3.2.2乙腈:液相色譜級。

　　3.2.3丙酮:液相色譜級。

　　3.2.4正丙醇:液相色譜級。

　　3.2.5正己烷:液相色譜級。

　　3.2.6乙酸乙酯:液相色譜級。

　　3.2.7乙醚。

　　3.2.8乙酸鈉。

　　3.2.9乙酸銨。

　　3.2. 10斤葡萄糖醛酸苷酶:約40 000活性單位。

　　3_2. 11乙腈飽和正己院：取200 mL正己院(3. 2.5)于250 mL分液漏斗中，加入少量乙腈(3.2.2),劇烈振搖，靜置分層后，棄去下層乙腈層即得。

　　3.2. 12丙酮-正己烷(1 + 9):丙酮(3. 2. 3)、正己烷(3. 2.5)按體積比1 : 9混勻。

　　3. 2. 13丙酮-正己烷(6+4):丙酮(3. 2. 3)、正己烷(3. 2. 5)按體積比6 : 4混勻。

　　3.2. 14乙酸乙酯-乙醚(75+25):75 1111^乙酸乙酯(3.2.6)與25 1111^乙醚(3.2.7)溶液混勻。

　　3.2. 15乙酸鈉緩沖液(0_ 1 mol/L):稱取乙酸鈉(3. 2. 8)13. 6 g于1 000 mL容量瓶中，加入980 mL

　　水溶解并混勻，用乙酸調pH到5.0,定容至刻度混勻。

　　3.2. 16乙酸銨溶液(10 mmol/L):稱取乙酸銨(3. 2. 9)0. 77 g于1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度混勻。

　　3.2. 17氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標準物質:純度>99.0%。

　　3.2. 18氯霉素氘代內標(氯霉素-D5)物質:純度>99. 9%。

　　3.2. 19標準儲備溶液:分別準確稱取適量的氯霉素、甲諷霉素和氟甲諷霉素標準物質(3. 2. 17)(精確 到0.1 mg),用乙腈配成5〇0 fig/mL的標準儲備溶液(4 °C避光保存可使用6個月)。

　　3.2.20氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標準中間溶液:分別準確移取適量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標準儲備溶液(3.2.19)，用乙腈稀釋成50 fxg/mL的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標準中間溶液(4 X：避光保存可使用3個月)。

　　3.2.21氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素混合標準工作溶液:分別準確移取適量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標準中間溶液(3. 2. 20)，用流動相稀釋成合適的混合標準工作溶液(現用現配)。

　　3.2.22氯霉素氘代內標(氯霉素-D5)儲備溶液:準確稱取適量的氯霉素-d5標準物質(3. 2.18)(精確到0• 1 mg)，用乙腈配成100 fzg/mL的標準儲備溶液(4 ^避光保存可使用12個月)。

　　3.2.23氯霉素氘代內標(氯霉素-D5)中間溶液:準確移取適量的氯霉素-d5儲備溶液(3. 2. 22)，用乙

　　4

　　腈配成1 Mg/mL內標中間溶液(4 °C避光保存可使用6個月)。

　　3.2.24氯霉素氘代內標(氯霉素-D5)工作溶液：準確移取適量的氯霉素-D5中間溶液(3. 2. 23)，用乙 腈配成〇• 1 Hg/mL內標工作溶液(4 °C避光保存可使用2周)。

　　3.2.25 LC-Si固相萃取柱或相當者:200 mg，3mL。

　　3.2.26 EN固相萃取柱或相當者:200 mg，3mL。

　　3.2.27 —次性注射式濾器:配有0.45 微孔濾膜。

　　3.3儀器和設備

　　3.3.1液相色譜-串聯質譜儀:配有電噴霧離子源。

　　3.3.2高速組織搗碎機。

　　3.3.3均質器。

　　3.3.4旋轉蒸發儀。

　　3.3.5分析天平。

　　3.3.6 移液槍:20〇ML、lmLD 3.3.7心形瓶:100mL，棕色。

　　3.3.8分液漏斗：200 mL。

　　3.3.9聚四氟乙烯離心管：50mL。

　　3. 3. 10離心機。

　　3.3.11渦旋混合器。

　　3.3.12固相萃取裝置。

　　3.4試樣制備與保存 3.4.1試樣的制備

　　從原始樣品中取出部分有代表性樣品，經高速組織搗碎機均勻搗碎或混勻，用四分法縮分出適量試樣，均分成兩份，裝入清潔容器內，加封后作出標記，一份作為試樣，一份作為留樣。

　　3.4.2試樣的保存

　　試樣應在一20 t條件下保存。

　　3.5測定步驟

　　3.5. 1提取

　　3.5. 1. 1動物組織(肝、腎除外)與水產品

　　稱取試樣5 g(精確至0.01 g),置于50 mL離心管中，加入100 氯霉素氘代內標(氯霉素-05)工

　　作溶液(3.2. 24)和30 mL乙腈，勻漿，離心5 min。將上清液移人250 mL分液漏斗中，加15 mL乙腈 飽和的正己烷(3. 2. 11)，振蕩5 min，靜置分層，轉移乙腈層至100 mL棕色心形瓶中。殘渣中再加入 30 mL乙腈，振搖3 min,離心5 min，取上清液轉移至同一分液漏斗，振蕩5 min,靜置分層，轉移乙腈層至同一棕色心形瓶中。向心形瓶中加入5 mL正丙醇，于40 °C水浴中旋轉蒸發近干，用氮氣吹干，加 5 mL丙酮-正己烷(3. 2.12)溶解殘渣。

　　3.5. 1.2動物肝、腎組織

　　稱取試樣5 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加人30 mL乙酸鈉緩沖液(3. 2. 15)，均質 2 min，加人300吣泠葡萄糖醛酸苷酶(3. 2. 10)，于37 °C溫育過夜。消解樣品中加人100 氯霉素氘

　　代內標(氯霉素-D5)工作溶液(3. 2. 24) ,20 mL乙酸乙酯-乙醚(3. 2. 14),振搖2 min,離心5 min。取上 層有機層人心形瓶中，在40 C水浴中旋轉蒸發近干，用氮氣吹干，加5 mL丙酮-正己烷(3. 2. 12)溶解 殘渣。

　　3.5. 1.3 蜂蜜

　　稱取蜂蜜試樣5 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加入100 /^氯霉素氘代內標(氯霉素- D5)工作溶液(3. 2.24)，5 mL水，混勻，再加人20 mL乙酸乙酯，振搖2 min,離心5 min，移取有機層到

　　100 mL棕色心形瓶中，于離心管中再加人20 mL乙酸乙酯，振搖2 min,離心5 min,合并有機層于棕色心形瓶中，40 C水浴中旋轉蒸發至干,3 mL水溶解殘渣,混勻。

　　3.5.2凈化

　　3.5.2. 1動物組織與水產品

　　用5 mL丙酮-正己烷(3. 2.12)淋洗LC-Si硅膠小柱，棄去淋洗液，將殘渣溶解溶液(3_ 5.1.1、3_ 5.1. 2) 轉移到固相萃取小柱上，棄去流出液，用5 mL丙酮-正己烷(3. 2.13)洗脫，收集洗脫液于心形瓶中，4〇 ^水 浴中旋轉蒸發至近干，氮氣吹干，用1 mL水定容，定容液過〇• 45 /xm濾膜(3. 2. 27)至進樣瓶，待測定。

　　3. 5. 2. 2 蜂蜜

　　分別用5 mL甲醇，5 mL水活化EN固相萃取柱，將提取液(3. 5. 1.3)轉移上柱，用5 mL水淋滌， 用玻璃棒壓干1 min,用3 mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液用氮氣吹干，用1 mL水定容，定容液通過0.45 fim 濾膜(3. 2. 27)至進樣瓶，待測定。

　　3.5.3液相色譜-質譜/質譜測定

　　3.5.3. 1液相色譜條件

　　a) 色譜柱：Zorbax SfrC18, 5/xm，2.1 mmXl50 mm，或與之相當者;

　　b) 流動相:水-乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫程序參見表2;

3. 5. 3. 2質譜/質譜條件 參見附錄C。

　　3. 5. 3. 3定性測定

　　按照上述條件測定樣品和建立標準工作曲線，如果樣品中化合物質量色譜峰的保留時間與標準溶液的保留時間相比在允許偏差士2. 5%之內;待測化合物定性離子對的重構離子色譜峰的信噪比大于或 等于3(S/N>3)，定量離子對的重構離子色譜峰的信噪比大于或等于l〇(S/N>10);定性離子對的相對豐度與濃度相當的標準溶液相比，相對豐度偏差不超過表3的規定，則可判斷樣品中存在相應的目標 化合物。氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素混合標準工作溶液的液相色譜-質譜/質譜多反應監測(MRM) 總離子流圖和重構離子色譜圖以及各目標化合物相對保留時間參見附錄D中圖D. 1?圖D. 5和 表 D.1。

　　表3定性時相對離子豐度的最大允許偏差

3. 5. 3. 4定量測定

　　氯霉素使用內標法定量;甲砜霉素和氟甲砜霉素使用外標法定量。

　　3.6結果計算

　　試樣中目標化合物殘留量使用儀器數據處理系統或氯霉素殘留量按式(2)計算，甲砜霉素和氟甲砜

　　霉素按式(3)計算:

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