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冬蟲夏草具有抗炎、抗腫瘤、降血糖、免疫調節、保護受損肝腎、鎮靜和抗疲勞等作用，冬蟲夏草的化學成分復雜，近五年有關冬蟲夏草化學成分測定方法的研究對象主要為核苷類、甘露醇、多種氨基酸、甾醇類及無機元素等。

檢測方法：近五年來冬蟲夏草中核苷類、甘露醇、多種氨基酸等成分的檢測方法，其中包括高效液相色譜法、毛細管電泳法、分光光度法等方法。

1、核苷類物質的測定

　　核苷類物質為冬蟲夏草的主要活性成分之一，具有廣泛的生理功能，其中以蟲草素、腺苷等具有明顯的藥理作用。近五年的測定方法主要為高效液相色譜法和毛細管電泳法。

1.1 HPLC方法測定

　　中藥成分非常復雜，HPLC因其具有各種分析柱、高選擇性和高靈敏度的檢測器，所以具備分離效能高、分析速度快、靈敏度高和適用范圍廣等優點，所以成為中藥研究的重要的分析方法。建立了冷凍保鮮冬蟲夏草中尿苷和腺苷的HPLC測定方法。采用Waters sunfire色譜柱(4.6mm×250mm，4.6μm)，流動相系統為乙腈和水的比例和體積流量的梯度洗脫程序，柱溫35℃，檢測波長260nm。結果尿苷和腺苷的線性范圍分別為0.0340～0.340μg，0.00494～0.0494μg，平均加樣回收率分別為98.70%(RSD為0.48%)、97.39%(RSD為1.6%)。該方法簡便快捷、準確精密、重復性好，能用于冷凍保鮮冬蟲夏草中腺苷和尿苷的同時測定。周偉平[2]等建立了采用Agilent EclipseXDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱同時測定西藏產冬蟲夏草中尿苷及腺苷的含量的方法，檢測波長為260nm，以甲醇-水為流動相梯度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫33℃。尿苷及腺苷的線性范圍為32.95～439.3μg/mL(r=0.9999)和3.486～46.48μg/mL(r=0.9999)，平均回收率分別為98.5%、95.6%，RSD值分別為1.8%和2.4%(n=6)。來自西藏的23批冬蟲夏草中尿苷的含量在1.209～2.192mg/g范圍內，腺苷含量在0.0838～0.884mg/g范圍內。該法簡便、準確，重復性好，可快速測定冬蟲夏草中尿苷和腺苷的含量，為控制西藏冬蟲夏草的質量提供參考依據。李秀敏[3]等建立了HPLC法測定中藥免疫調節方冬蟲夏草中腺苷的含量的方法。采用C18色譜柱Hypers LDSC 18mm(4.6mm×250mm，5μm)，流動相水-甲醇(85：15)，流速1mL/min，檢測波長260nm，進樣量10μL，柱溫25℃。樣品預處理方法以在室溫下用體積分數50%的甲醇超聲波提取60min。結果冬蟲夏草中的腺苷質量分數為0.097～0.582mg/mL與峰面積呈良好線性關系。腺苷平均加樣回收率為100.88%，RSD%=1.43%。該方法可用于中藥免疫調節方冬蟲夏草中腺苷的含量測定。建立了冬蟲夏草核苷類物質的微量提取方法，在優化的HPLC-UV色譜條件下，鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷和蟲草素等5種冬蟲夏草主要核苷類物質的標準品分離完全。精密度、穩定性和回收率實驗表明，用HPLC-UV方法即可定量分析冬蟲夏草的核苷類有效成分。用該方法檢測到這5種核苷類物質含量在冬蟲夏草子座部分與其蟲體部分之間以及冬蟲夏草居群間存在顯著差異。結果表明冬蟲夏草主要核苷類成分的有效定量分析方法的建立對冬蟲夏草的品質評價及質量控制具有重要的現實意義，也為進一步研究影響冬蟲夏草品質的因素并建立品質評價體系奠定了基礎。

　　蟲草素，-脫氧腺苷(-deoxyadenosine)為含氮配糖體的核酸衍生物，屬嘌呤類生物堿，是一種核苷類抗生素。蟲草素具有抑制微生物生長、抗腫瘤、調節免疫、抗炎等藥理作用，建立了測定北冬蟲夏草子實體中蟲草素的高效液相色譜法。使用Eclipse XDB C18 (4.6mm×150mm，5μm)色譜柱，以水：甲醇：甲酸(95：4：1)為流動相，流速為0.8mL/min，25℃下檢測，檢測波長為260nm。結果表明蟲草素的平均回收率為100.8%，RSD值1.88%，此方法簡單、可靠。一種新的反相高效液相色譜方法，用于蛹蟲草中腺苷和蟲草素的定性定量分析。樣品經水超聲提取，以終濃度20mmoL/L檸檬酸、40mmoL/L醋酸、20mmoL/L三乙胺的混合溶液-乙腈(體積比98：2)為流動相，流速1.0mL/min，色譜柱Capcellpak C18(150mm×4.6mm，5μm)分離，柱溫40℃，進樣量10μL，紫外檢測波長260nm。在此條件下，腺苷在1～1000μg/mL范圍內有良好的線性關系，檢測限0.2μg/mL，回收率93.75%～96.90%，RSD為0.116%;蟲草素在2～1000μg/mL范圍內有良好的線性關系，檢測限0.2μg/mL，回收率92.03%～97.35%，RSD為0.104%。該方法樣品處理簡便、分離度高、雜質干擾小、回收率高、重復性好，能夠對蛹蟲草中腺苷和蟲草素進行準確的定性定量分析。

1.2 毛細管電泳法測定

　　用聚甲基丙烯酸丁酯(PBMA)整體柱毛細管電色譜法測定冬蟲夏草中胞苷和腺苷的含量。采用自制的PBMA電色譜整體柱(總長為34.5cm，有效長度26.0cm)，流動相20mmoL/L硼砂水溶液(pH3.5)，運行電壓15kV，壓力進樣(6×105)Pa×0.1min，柱溫30℃，檢測波長214nm，內標溶液100μg/mL甲氧芐啶(TMP)溶液(乙醇-流動相1：1為溶劑)。檢測結果為兩核苷在12.5～125mg/L線性關系良好。檢測限為(S/N=3)及定量限(S/N=10)分別為：胞苷2.14mg/L，7.14mg/L;腺苷1.88mg/L，6.25mg/L。兩核苷加樣回收率在97.2%～103.5%，RSD在0.9%～2.6%。應用毛細管區帶電泳法測定分別以冬蟲夏草菌絲體粉和鹿茸血為主要原料制品中的多種核苷和堿基成分。對實驗條件進行了優化，結果表明，以20mmoL/L硼砂-15mmoL/Lβ-環糊精為緩沖溶液(pH=9.4)，分離電壓22kV，檢測波長254nm，電動進樣為10kV、5s時，在10min內同時分離測定了蟲草素、腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、腺苷、次黃嘌呤、尿苷、鳥苷和肌苷。各組分在0.2～200μg/mL范圍內呈線性關系，檢出限范圍0.07～1.67μg/mL。5個批次的冬蟲夏草菌絲粉保健品中腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、鳥苷、尿苷5組分的定量結果分別在0.15～0.19mg/g、0.72～0.92mg/g、1.44～1.59mg/g、1.51～2.32mg/g和1.77～2.56mg/g范圍內，加標回收率的范圍是82.83%～109.21%;2個批次的鹿茸血保健品中次黃嘌呤、尿苷的定量結果在36.55～49.97ug/mL和86.08～108.97ug/mL范圍內，加標回收率的范圍分別是89.68%～96.79%和99.05%～102.81%。探索冬蟲夏草不同的預處理方法，以便更好地反映冬蟲夏草的譜圖信息。方法采用不同的預處理方法，比較操作方法和所得樣品溶液。通過比較發現，在以下電泳條件及改進索氏提取法所得譜圖峰形好，信息多。電泳條件：未涂漬彈性石英毛細管(75μm×60cm)，緩沖溶液40mmoL/L硼砂溶液，電泳電壓20kV;進樣時間3s，室溫，檢測波長250nm。通過比較多種預處理方法，上述預處理方法操作簡便，所得溶液澄清透明。對毛細管電泳法分離15種核苷類化合物所用的不同緩沖液體系進行了系統比較，確定不同模式毛細管電泳法分析多種核苷類化合物的適合背景緩沖液體系(BGE)。分別以四硼酸鈉、磷酸氫二鈉、乙酸鈉、碳酸氫鈉、乙酸銨和乙二胺(DEA)為背景電解質，對毛細管區帶電泳(CZE)、毛細管電泳-電噴霧飛行時間質譜(CE-ESI-TOF/MS)以及膠束電動毛細管電泳(MEKC)3種模式進行比較，并對其中幾種優勢緩沖體系進行了優化。建立了簡單、快速測定冬蟲夏草和人工蛹蟲草子實體中蟲草素、腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、次黃嘌呤、腺苷、鳥苷、尿苷、次黃苷9個核苷及堿基類成分的高效毛細管區帶電泳法，比較天然冬蟲夏草與人工蛹蟲草子實體中核苷及堿基類化合物的含量。方法采用未涂層熔硅彈性石英毛細管(75um×60.5cm，有效長度50cm)，以pH9.0的0.05moL/L硼砂-硼酸(8：2，含硼酸根的濃度為0.2moL/L)作為緩沖體系，分離電壓20kV，溫度20，檢測波長258nm，進樣量為3.445kPa，進樣5s。結果在優化的實驗條件下，冬蟲夏草及人工蛹蟲草子實體中上述9個核苷及堿基類成分在15min內達到基線分離;核苷及堿基類成分的濃度在1.0～205.5μg/mL范圍內與峰面積呈現良好的線性關系，相關系數為0.9995～0.9999，樣品回收率為95.3%～106.5%。結果表明人工蛹蟲草子實體與天然蟲草有相似的核苷及堿基成分，但在含量上有較大差異。新建的方法操作簡便，實驗消耗低，高效而快速，可以成為冬蟲夏草及代用產品中核苷及堿基類成分檢測的一種簡便、價廉、有效的分析方法。 　　

2、氨基酸含量的測定

　　冬蟲夏草中含蛋白質20.06%～26.40%，由天門冬、蘇、絲、谷、脯、甘、纈、蛋、異亮、亮、酪、苯丙、賴、組、胱、半胱、精、色氨酸18種組成。以精氨酸、谷氨酸、色氨酸及酪氨酸等為藥理學主要成分，氨基酸是蟲草補益強壯作用和增強免疫功能的物質基礎之一，建立了一種快速測定冬蟲夏草中氨基酸含量的HPLC方法。采用柱前鄰苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯聯合在線自動衍生，二元梯度洗脫(流動相A：40mmoL/LNaH2PO4、H2O，pH7.8、流動相B：乙腈-甲醇-水=4.5/4.5/1，v/v)，反相C18短柱分離(Zorbax Eclipse AAA C18色譜柱、75mm×4.6mm，3.5μm)，二極管陣列檢測器(檢測波長338nm、參考波長390nm)和熒光檢測器(激發波長340nm，發射波長450nm)聯合檢測，內標量。結果各氨基酸含量在4.5～1000μmoL/L范圍內線性關系良好(相關系數為0.9914～0.9997)，除蛋氨酸(部分氧化降解)為85.12%外，其他各氨基酸的加標回收率為95.10%～103.29%，相對標準偏差2.03%～5.12%(n=5)。為研究冬蟲夏草游離氨基酸的測定方法，利用液相色譜建立了冬蟲夏草中游離氨基酸的分析方法。以0.1moL/L鹽酸為萃取劑，0.2mL1.0g/L的L-正纈氨酸為內標溶液，超聲萃取20min，以鄰苯二甲醛為衍生化試劑，WatersC18色譜柱進行分離，熒光檢測器進行檢測。回收率94.62%～101.44%，RSD=1.06%～4.61%(n=6)。該方法簡便、準確、重現性好，適于冬蟲夏草中游離氨基酸的分析。

3、其他成分的測定

3.1無機元素的測定

　　北冬蟲夏草中無機元素，結果該方法的加標回收率為97.5%～108.6%，RSD為0.10%～4.30%，檢出限為0.0004～0.0945mg/L，具有良好的準確度和精密度。結論北冬蟲夏草中Cu、Mn、Mg、K、Fe元素含量較為豐富，實驗結果為北冬蟲夏草中元素含量與其藥效的相關性提供科學數據。

　　用ICP-AES測定了7產地人參、6產地鹿茸和4產地冬蟲夏草中的P、B、Zn、Fe、Cu、Na、K、Mg、Mn、Ca10種元素的含量，比較了K與Na、Ca與Mg、Zn與Cu、Fe與Mn、P與B的含量比例關系。結果表明不同產地人參、鹿茸和冬蟲夏草的10種元素的5個比例值存在顯著性差異。此結果可用來鑒定是否為原產地人參、鹿茸及冬蟲夏草。

3.2甘露醇、麥角甾醇的測定

　　冬蟲夏草藥材粉末經甲醇超聲提取后，用RP-HPLC測定。采用Phenomenex Luna C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，流動相為甲醇-水(98∶2);流速為1mL/min;檢測波長為282nm。檢測結果麥角甾醇進樣量在0.04272～0.4272μg與峰面積呈良好的線性關系，麥角甾醇的平均回收率為98.7%(n=6)。采用此方法測定冬蟲夏草藥材中麥角甾醇的含量，方法靈敏、快速、準確。采用水提回流離心的方法，提取分離人工培殖冬蟲夏草中D-甘露醇，用高碘酸鈉與甘露醇反應產生黃色的3，5-二乙酰-1，4-脫氫二甲基吡啶，在波長412nm處測定其大吸收。甘露醇濃度在10～50mg/L之間時，與吸光值有良好線性關系，線性方程為C=79.172x-0.0713，相關系數r=0.9999。人工培殖冬蟲夏草中D-甘露醇的含量分別為89.64mg/g

　　(2005年)、91.86mg/g(2006年)、94.71mg/g(2007年)、98.98mg/g(2008年)、97.50mg/g(2009年)、94.71mg/g(野生)和96.84mg/g(野生)。

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