做精子畸形試驗(yàn)ISO10993找權(quán)威實(shí)驗(yàn)室上海飛凡13764818040（黃工） 1 范圍 本規(guī)范規(guī)定了動(dòng)物精子畸形試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。 本規(guī)范適用于化妝品原料的遺傳毒性檢測(cè)。 2 引用標(biāo)準(zhǔn) GB 14924 試驗(yàn)動(dòng)物與飼料標(biāo)準(zhǔn) GB 15193?94 食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序 3 定義 精子畸形 （sperm malformation） 指精子形態(tài)的異常改變。 4 原理 已知精子畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果。常染色體和Y-性連鎖基因突變及某些染色體重排，如性-常染色體易位，也可使精子發(fā)生畸形。 小鼠精子畸形試驗(yàn)?zāi)茉u(píng)價(jià)受試物對(duì)精子生成、發(fā)育的影響，可檢測(cè)受試物在體內(nèi)對(duì)生殖細(xì)胞的遺傳毒性作用。 5 試驗(yàn)的基本原則 通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩绞箘?dòng)物接觸受試物，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后處死動(dòng)物，取其附睪，制備涂片，經(jīng)固定、染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)畸形精子。 6 儀器和器械 生物顯微鏡、解剖剪、鑷子、表面皿、離心管、小漏斗、吸管、滴管、載玻片、擦鏡紙等。 7 試劑 7.1 1%伊紅染色液 稱(chēng)取伊紅1g溶于100mL蒸餾水中。 7.2 生理鹽水、甲醇（A.R） 8 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境 常規(guī)使用動(dòng)物是雄性小鼠。6周~8周齡，體重為30g ~35g。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國(guó)家相應(yīng)規(guī)定。 9 劑量分組 受試物至少設(shè)三個(gè)劑量組。分別取1/2、1/5、1/10或1/20LD50劑量。當(dāng)受試物的LD50大于5g/kg體重時(shí)，可取5g/kg體重為高劑量。另外設(shè)陰性（溶劑）對(duì)照組和陽(yáng)性物對(duì)照組。常用溶劑為水、生理鹽水、植物油（玉米油、花生油）等。陽(yáng)性物對(duì)照組可采用環(huán)磷酰胺40mg/kg/ 每組至少有5只存活動(dòng)物。 10 染毒途徑和方式 染毒途徑視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā３Ｓ猛緩綖榻?jīng)口灌胃方式。受試物各劑量組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性物對(duì)照組的動(dòng)物，均連續(xù)染毒5d，每日一次。一般于首次染毒后的第35d處死動(dòng)物。 11 試驗(yàn)方法 11.1 制片 用頸椎脫臼法處死小鼠，剖開(kāi)腹腔，暴露睪丸，分離兩側(cè)附睪，用眼科剪剖開(kāi)附睪組織，與適量生理鹽水混勻，涂片。 11.2 固定 待涂片干燥后，放入甲醇（A.R）液中固定5min。取出晾干。 11.3 染色 將涂片于1%伊紅染液中染色1h，然后用蒸餾水輕輕沖洗，晾干。 11.4 觀察與計(jì)數(shù) 首先，在低倍鏡下選擇背景清晰、精子分布均勻、重疊較少的區(qū)域，然后，在高倍鏡下觀察結(jié)構(gòu)完整的1000個(gè)精子，計(jì)數(shù)其中畸形的精子。精子畸形主要表現(xiàn)在頭部。按Wyrobeks的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，主要類(lèi)型有：無(wú)鉤、香蕉形、無(wú)定形、胖頭、尾折疊、雙頭及雙尾。無(wú)尾精子、頭部重疊的或整個(gè)與另一個(gè)重疊的精子均不計(jì)數(shù)。判斷雙頭、雙尾精子時(shí)，要注意與兩條精子的部分重疊相區(qū)別。 12 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷 每只動(dòng)物應(yīng)按精子畸形類(lèi)型分別記錄，以便計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的精子畸形發(fā)生率和精子畸形類(lèi)型的構(gòu)成比。 利用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)法和其他適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法。將受試物各劑量組精子畸形發(fā)生率分別與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較。 精子畸形試驗(yàn)陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)是畸形發(fā)生率至少為陰性對(duì)照組的倍量或經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異，并存在劑量-反應(yīng)關(guān)系者。 一般正常小鼠的精子畸形率為0.8%~3.4%，但每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有自己穩(wěn)定的精子自發(fā)畸形率。 13 試驗(yàn)報(bào)告 試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容： （1）受試物名稱(chēng)、理化性狀、配制方法、所用溶劑； （2）動(dòng)物種屬和品系、體重、數(shù)量、來(lái)源（注明合格證號(hào)和動(dòng)物級(jí)別）； （3）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來(lái)源、室溫、相對(duì)濕度、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室合格證號(hào)； （4）劑量分組，染毒途徑和方式； （5）試驗(yàn)方法：簡(jiǎn)述操作步驟，所用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法； （6）結(jié)果：以列表方式報(bào)告受試物對(duì)動(dòng)物精子畸形發(fā)生率和精子畸形類(lèi)型分析的結(jié)果 （表1和表2）； （7）結(jié)論。 涉及地區(qū)：廣東省、浙江省、福建省、海南省、云南省、廣西省、貴州省、新疆省、四川省、重慶市、西藏省、湖南省、江西省、湖北省、上海市、北京市、天津市、安徽省、江蘇省、甘肅省、寧夏省、內(nèi)蒙古省、黑龍江省、吉林省、遼寧省、山東省、陜西省、山西省、河南省、河北省