體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗上海飛凡出具權(quán)威報告。上海飛凡檢測認證中心，國家認可一站式體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗檢測服務(wù)機構(gòu)，24小時免費服務(wù)熱線：4007726386 1 范圍 本規(guī)范規(guī)定了體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗的基本原則、要求和方法。 本規(guī)范適用于檢測化妝品原料及其產(chǎn)品的致突變性。 2 規(guī)范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3 試驗?zāi)康?本試驗是用于檢測培養(yǎng)的哺乳動物細胞染色體畸變，以評價受試物致突變的可能性。 4 定義 染色體型畸變(Chromosome-type aberration)：染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為在兩個染色單體相同位點均出現(xiàn)斷裂或斷裂重組的改變。 染色單體型畸變(Chromatid-type aberration)：染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組的損傷。 染色體數(shù)目改變(Numerical aberration)：所用細胞株的正常染色體數(shù)目的變化。 結(jié)構(gòu)畸變(Structural aberration)：在細胞分裂的中期相階段，用顯微鏡檢出的染色體結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為缺失、斷片、互換等。 有絲分裂指數(shù)(Mitotic index)：中期相細胞數(shù)與所觀察的細胞總數(shù)之比值；是一項反映細胞增殖程度的指標。 5 試驗基本原則 在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使培養(yǎng)的哺乳動物細胞暴露于受試物中。用中期分裂相阻斷劑（如秋水仙素或秋水仙胺）處理，使細胞停止在中期分裂相，隨后收獲細胞，制片，染色，分析染色體畸變。 6 試驗方法 6.1 試劑和受試物制備 6.1.1 陽性對照物：可根據(jù)受試物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選擇適宜的陽性對照物，陽性對照物應(yīng)是已知的斷裂劑，能引起可檢出的、并可重復(fù)的陽性結(jié)果。當外源性活化系統(tǒng)不存在時，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亞硝基脲(ethyl nitrosourea)、絲裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。當外源性活化系統(tǒng)存在時，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 陰性對照物：應(yīng)設(shè)陰性對照，即僅含和受試物組相同的溶劑，不含受試物，其它處理和受試物組完全相同。此外，如未能證實所選溶劑不具有致突變性，溶劑對照與本實驗室空白對照背景資料有明顯差異，還應(yīng)設(shè)空白對照。 6.1.3 受試物 6.1.3.1 受試物的配制：固體受試物需溶解或懸浮于溶劑中，用前稀釋至適合濃度；液體受試物可以直接加入試驗系統(tǒng)和/或用前稀釋至適合濃度。受試物應(yīng)在使用前新鮮配制，否則就必須證實貯存不影響其穩(wěn)定性。 6.1.3.2 溶劑的選擇：溶劑必須是非致突變物，不與受試物發(fā)生化學反應(yīng)，不影響細胞存活和S9活性。可以選擇]溶劑是培養(yǎng)液（不含血清）或水。二甲基亞砜（DMSO）也是常用溶劑，使用時濃度不應(yīng)大于0.5%。 6.1.3.3 受試物濃度設(shè)置 （1） 高濃度的選擇：決定高濃度的因素是細胞毒性、受試物在試驗系統(tǒng)中的溶 解度以及pH或滲克分子濃度(osmolality)的改變。 （2） 細胞毒性的確定：應(yīng)使用指示細胞完整性和生長情況的指標，在活化系統(tǒng)存在 或不存在的兩種條件下確定細胞毒性，例如細胞覆蓋程度（degree of confluency）、存活細胞計數(shù)(viable cell counts)或有絲分裂指數(shù)(mitotic index)。應(yīng)在預(yù)試驗中確定細胞毒性和溶解度。 （3） 劑量設(shè)置：①至少應(yīng)設(shè)置3個可供分析的濃度。當有細胞毒性時，其濃度范 圍應(yīng)包括從大毒性至幾乎無毒性；通常濃度間隔系數(shù)不大于 2 ~10。 ②在收獲細胞時，高濃度應(yīng)能明顯降低細胞覆蓋程度、細胞計 數(shù)或有絲分裂指數(shù)（均應(yīng)大于50%）。 ③對于那些相對無細胞毒性的化合物，高濃度應(yīng)是5μl/mL， 5mg/mL或0.01mol/L。 ④對于相對不溶解的物質(zhì)，當濃度低于不溶解濃度時仍無毒性， 則高劑量應(yīng)是，當處理期結(jié)束時，在終培養(yǎng)液中溶解度限 值以上的一個濃度。在某些情況下（即僅當高于低不溶解濃 度時才發(fā)生細胞毒性），應(yīng)使用一個以上可看見沉淀的濃度。 好在試驗處理開始和結(jié)束時均評價溶解度，因為由于細胞、S9 等的存在，在試驗系統(tǒng)內(nèi)在暴露過程中溶解度可能變化。不溶 解性可用肉眼鑒別，但沉淀不能影響觀察。 6.1.4 培養(yǎng)液：采用MEM(Eagle)，并加入非必需氨基酸和抗菌素（青、鏈霉素，按100IU/mL），胎牛血清或小牛血清按10%加入。也可選用其它合適的培養(yǎng)液。 6.1.5 活化系統(tǒng) 通常使用的是S9混合物（S9 mix）。S9是從經(jīng)酶誘導(dǎo)劑（Aroclor 1254或苯巴比妥鈉和β-萘黃酮聯(lián)合使用）處理的嚙齒動物肝臟獲得的。S9的制備同Ames試驗。S9的使用濃度為1%~10%（終濃度）。S9 mix中所加輔助因子的量由各實驗室自行決定，但需對S9mix的活性進行鑒定，必須能明顯活化陽性對照物。也可使用下述 S9 0.125ml MgC12 （0.4 mol/L） 0.02 ml KC1（1.65mol/L） 0.02 ml 葡萄糖-6-磷酸 1.791mg 輔酶Ⅱ（氧化型，NADP） 3.0615mg 用無血清MEM培養(yǎng)液補足至1mL. 6.2 試驗步驟 6.2.1 細胞：使用中國地鼠卵巢（CHO）細胞株或中國地鼠肺（CHL）細胞株。 6.2.2 試驗時，應(yīng)同時設(shè)陽性對照物，陰性對照物和至少3個可供分析的受試物濃度組。 6.2.3 試驗前一天，將一定數(shù)量的細胞接種于培養(yǎng)皿（瓶）中，放CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 6.2.4 試驗需在加入和不加入S9 mix的條件下進行。試驗時，吸去培養(yǎng)皿（瓶）中的培養(yǎng)液，加入一定濃度的受試物、S9 mix（不加S9 mix時，需用培養(yǎng)液補足）以及一定量不含血清的培養(yǎng)液，放培養(yǎng)箱中處理2h~6h。結(jié)束后，吸去含受試物的培養(yǎng)液，用Hanks液洗細胞3次，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱，于24h內(nèi)收獲細胞。于收獲前2h~4h，加入細胞分裂中期阻斷劑（如用秋水仙素，作用時間為4h，終濃度為1μg/mL）。 當受試物為原料時, 如果在上述加入和不加入S9 mix的條件下均獲得陰性結(jié)果，則尚需補加另外的試驗，即在不加S9 mix的條件下，使受試物與試驗系統(tǒng)的接觸時間延長至24h。 當難以得出明確結(jié)論時，應(yīng)更換試驗條件，如改變代謝活化條件、受試物與試驗系統(tǒng)接觸時間等重復(fù)試驗。 6.2.5 收獲細胞時，用0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，待細胞脫落后，加入含10%胎牛或小牛血清的培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的作用，混勻，放入離心管以1000r/min~1200r/min的速度離心5min~7min，棄去上清液，加入0.075mol/L KC1溶液低滲處理，繼而以新配制的甲醇和冰醋酸液（容積比為3:1）進行固定。按常規(guī)制片，用姬姆薩染液染色。 6.2.6 作染色體分析時，對每一處理組選200個（陽性對照可選100個）分散良好的中期分裂相（染色體數(shù)為2n±2）進行染色體畸變分析。在分析時應(yīng)記錄每一觀察細胞的染色體數(shù)目，對于畸變細胞還應(yīng)記錄顯微鏡視野的坐標位置及畸變類型。 6.3 統(tǒng)計處理：對染色體畸變細胞率用X2檢驗，以評價受試物的致突變性。 6.4 結(jié)果評價：在下列兩種情況下可判定受試物在本試驗系統(tǒng)中具有致突變性： （1）受試物引起染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)的增加具有統(tǒng)計學意義，并有與劑量相關(guān)的增加。 （2）受試物在任何一個劑量條件下，引起具有統(tǒng)計學意義，并有可重復(fù)性的陽性反應(yīng)。 在評價時應(yīng)把生物學和統(tǒng)計學意義結(jié)合考慮。 7 試驗報告 試驗報告應(yīng)包括以下內(nèi)容： （1）受試物名稱、有關(guān)的理化性狀、所用溶劑及其配制、劑量選擇（應(yīng)說明受試物對細胞毒 性的測定方法、溶解情況等）; （2）細胞株名稱; （3）實驗條件和方法 ①代謝活化系統(tǒng)：制備S9時所用酶的誘導(dǎo)劑、選用的動物品種和來源、S9mix的配方； ②對照物：陽性對照物名稱和選用濃度；陰性（溶劑）對照物名稱及使用濃度。 ③培養(yǎng)液：所用培養(yǎng)液名稱、血清類別和使用濃度； ④接種時的細胞密度以及所用培養(yǎng)皿（瓶）的規(guī)格； ⑤中期分裂阻斷劑：名稱、所用濃度、作用時間； ⑥處理時間：受試物與試驗系統(tǒng)的接觸時間； ⑦簡述制片方法、分析的中期分裂相數(shù)目、結(jié)果評價方法。 （4）結(jié)果 ①受試物高劑量的確定及試驗結(jié)果：細胞毒性的測定（建議的表格見表1）；溶解情況 （建議的表格見表2）；對pH和滲克分子（osmolality）濃度的影響（如果有影響）。 ②各處理組和對照組染色體畸變率（建議的表格見表3）。 ③本實驗室的陽性對照組和陰性對照組（常用溶劑，如DMSO）在本實驗室歷史上的染 色體畸變率范圍、均值和標準差（說明樣品數(shù)）。 （5）結(jié)論。 涉及地區(qū)：廣東省、浙江省、福建省、海南省、云南省、廣西省、貴州省、新疆省、四川省、重慶市、西藏省、湖南省、江西省、湖北省、上海市、北京市、天津市、安徽省、江蘇省、甘肅省、寧夏省、內(nèi)蒙古省、黑龍江省、吉林省、遼寧省、山東省、陜西省、山西省、河南省、河北省