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生物樣品掃描電鏡

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　　生物樣品掃描電鏡常規掃描電鏡對樣品要求:必須是干燥的，不含水分或揮發性物質;具有一定機械強度,能耐受電子束轟擊；具有導電性，被激發時能夠產生足夠的二次電子。生物材料特點:含水分多，質地柔軟，機械強度小;組成元素的原子序數低，導電性差,激發后二次電子的產額較少。制樣的任務:通過一系列處理,既要盡量地保存材料的固有形態，又要改良其物理性能，使其適合在電鏡下觀察成像。　　電鏡是進行材料表征時用到一種重要工具，幫助觀察材料的微觀形貌。然而，在觀察軟/濕生物材料時(離體組織，帶細胞材料等)，涉及到觀察樣品的固定、脫水、干燥、金屬濺射等步驟，處理復雜，耗時較長。　　冷凍的水凝膠觀察　　生物樣品掃描電鏡的構成：　　主要四大系統：電子光學系統、信號收集及顯示系統、真空系統和電源系統。　　（1）電子光學體系：主要包括電子槍、電磁透鏡、掃描線圈和樣品室等部件。　　電磁透鏡：聚焦電子槍束斑，束斑越小，成像單元越小，分辨率越高。　　掃描線圈：使電子束偏轉，在樣品上做光柵狀掃描，激發多種電子信號。　　樣品室：放置樣品，并安裝有各種信號探測器。　　（2）信號收集及顯示系統：收集樣品在入射電子束作用下產生的各種信號，二次電子、背散射電子、特征X射線等，并進行放大轉換顯示在顯示系統上像。　　（3）真空系統：場發射電子顯微鏡的電子槍需要高真空度，所以配有2臺離子泵，1臺分子泵和一臺機械抽空泵。　　（4）電源系統：包括啟動的各種電源，檢測-放大系統，真空系統和成像系統等。　　分辨率的下降，掃描樣品在干燥過程中，由于失去水分會造成組織和細胞結構發生皺縮。此外，液體巨大的表面張力，將對細胞超微結構產生嚴重的影響。因此，生物樣品的干燥是掃描制備中的關鍵。樣品觀察表面必須具有良好的導電性和較高的二次電子發射率　　生物樣品掃描電鏡掃描圖像的質量與樣品受激發產生的二次電子的多少有很大的關系。對于一幅由10°個像素組成的圖像，生物樣品掃描電鏡掃描探針在樣品的每個掃描點上要產生平均6個二次電子，對于生物樣品，一般只能產生0.1~2個二次電子，使得圖像的質量與分辨率均受到影響。另一方面由于生物樣品的導電性較差，入射電子在樣品表面堆積，容易形成充放電現象，造成忽亮忽暗、全黑全白、圖像錯位等反常圖像。因此，提高樣品的導電性、消除充放電效應和增強二次電子發射率是生物樣品掃描制備的另一個基本要求。　　低真空下電鏡觀察葉子氣孔　　是在真空狀態下觀察樣品的表面形態。而生物樣品主要特點是含水量多，脫水干燥過程中容易收縮變形;大多數生物組織由碳、氫、氧、磷、鉀等原子序數較低的元素組成，不易激發二次電子，導電性較差。因此制備的樣品要求滿足以下條件。　　1．樣品觀察表面必須真實　　樣品觀察表面必須保持其在活休狀態時的形貌。在樣品處理中要去掉覆蓋在表面的灰塵、粘液、蠟質等雜質。此外，取樣時避免機械損傷。　　2．樣品必須干燥且不變形　　含水的生物樣品在真空條件下極易揮發，因此，在掃描觀察時樣品必須干燥，以防水分的蒸發影響儀器的真空度　　注意事項：　　1.細菌和真菌的處理方法與細胞一樣，但固定時間需延長（幾小時甚至過夜）；　　2.在樣品制備的過程中應始終保持樣品濕潤，切勿讓樣品干裂；　　3.由于掃描電鏡觀察樣品表面，因此一定要沖洗干凈樣品表面的殘余雜質；　　4.較大樣品需將樣品切成片狀，厚度不超過2-3mm。　　一、取樣：　　選取觀察材料需根據材料的特性與觀察目的的不同，采取不同的方法。取樣的基本要求:取材動作迅速;取材部位準確;固定及時;避免機械損傷。體積的大小沒有太大的限制，觀察表面的面積通常不超過10mm×10mm，厚度約兒個毫米。對于一些微小的單體材料（如游離細胞、細菌、線蟲等)，取樣時應注意材料數量要取夠，防止在制備過程中由于丟失造成材料不足而影響觀察。對于樣品斷裂面的獲取最好采用冷凍斷裂的方法。　　二、清洗：　　樣品的清洗主要有二個作用。其一是用清洗液除去樣品觀察表面的雜質或異物，其二是用緩沖液清洗掉沒有與樣品結合的固定劑。　　用清洗液清洗去除樣品表面的灰塵、粘液、油脂、蠟質等，可使樣品表面充分暴露。清洗液有雙蒸水、生理鹽水、含酶的清洗液、各種緩沖液、有機溶劑等。清洗的方法可采用氣吹、沖洗、刷洗、超聲波清洗等方法。清洗過程中要避免對樣品表面細微結構損傷。清洗的具體做法可根據研究l的、樣品性質和樣品對環境變化的敏感程度選用不同的清洗液和清洗方法。　　三、固定　　固定的目的是利用固定劑保存樣品細胞內的各種成分和結構，使它盡可能接近活體狀態。固定的方法的是戊二醛——餓酸雙固定，其中餓酸固定還具有增加組織的導電性的作用。對一些觀察倍數要求不是很高的材料，可只用戊二醛單固定。對一些形態結構不易發生變化的材料（如種子、某些花粉、孢子等)，甚至可以不用固定。固體培養基上培養的真菌、菌絲之類的材料，可用餓酸蒸氣薰蒸加以固定。培養細菌的菌毛在取樣之前，可先加入戊二醛固定。　　固定劑的種類、配制方法、固定時間和操作條件及要求與透射電鏡樣品固定處理基木相同。　　四、脫水　　掃描電鏡樣品脫水的目的是用脫水劑取代樣品中的游離水，為了使樣品在干燥過程中，避免樣品中水分直接蒸發時產生巨大的表面張力(水的表面張力在20℃時達46000kg/cm3),使樣品結構遭到損傷。常用的脫水劑是乙醇和丙酮，采用等梯度系列脫水的方法，脫水時間間隔5~15分鐘。在100%脫水劑中要過2~3次。　　螨蟲自然風干電鏡直接觀察　　選擇電鏡　　1、如果需要研究樣品的內部結構,例如細胞器的改變,則應選擇透射電鏡觀察　　2、如果需要研究樣品表面的形態結構,如細胞的外形、細胞的生長形態等,則應選擇掃描電鏡觀察　　生物樣品取材、固定、保存　　1、透射電鏡樣品: 　　1) “快速"：指盡量在活體條件下取材或動物斷血后2分鐘內取材,并迅速將組織放入電鏡專用3.5%戊二醛固定液內(不可用酒精或消毒級戊二醛固定),并于4℃冰箱內保存,切忌樣品結冰。　　2) “準確"：指取材部位要準確。取材的器械要鋒利,盡量減少對組織的牽拉和擠壓。　　3) “體積小、低溫"：指組織厚度不應大于3mm,取材溫度最好控制在4℃左右進行操作。　　2、掃描電鏡樣品　　1) 取材時還應盡量保護觀察面,避免用鑷子夾持觀察區域,在固定前,通常應用適當的清洗液清洗樣品表面的雜質,灰塵,粘液等附著物。　　2) 常用的清洗波有蒸餾水、生理鹽水、各種緩沖液或含酶的清洗液。　　3) 樣品取好后,放入3.5%戊二醛固定液內固定,保存在4℃冰箱中，切忌樣品結冰。　　流程　　1、透射電鏡　　取樣——3.5%戊二醛前固定；1%鐵酸后固定——酒精、丙酮逐級梯度脫水——Epon-618滲透、包理——半薄切片——光鏡選區定位——修塊——超薄切片機切片——檸檬酸鉛、醋酸鈾雙染色——透射電鏡觀察——攝片——分析+報告　　2、掃描電鏡樣品　　1) 取材——清洗——固定——冷凍——SEM觀察（冷凍電鏡）　　2) 取材——清洗——固定——脫水——干燥——鍍膜——SEM觀察（常規檢測）　　3) 取材——清洗——固定——組織導電處理——脫水——SEM觀察（特殊樣品，例如外泌體）生物樣品掃描電鏡http://www.yuxiubio.com/Products-33656721.html http://www.yuxiubio.com/

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