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重組人胱天蛋白酶14蛋白

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DM

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6

主要規(guī)格：
電詢

用　　途：
實驗

重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 一、試劑準備 1. SDS-PAGE試劑：見聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗。 2. 勻漿緩沖液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巰基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 顯色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸鎳胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。二、蛋白樣品制備 1. 單層貼壁細胞總蛋白的提取（1）倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。（2）每瓶細胞加3 ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1 min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）（4）每瓶細胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動。（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）（6）于4℃下12000 rpm離心5 min。（提前開離心機預(yù)冷）（7）將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml的離心管中放于－20℃保存。 2. 組織中總蛋白的提取（1）將少量組織塊置于1～2 ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。（2）加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進行勻漿。然后置于冰上。（3）幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。（4）裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中，然后在4℃下12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。 3. 加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取由于受藥物的影響，一些細胞脫落下來，所以除按1操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細胞。以下是培養(yǎng)液中細胞總蛋白的提取：（1）將培養(yǎng)液倒至15 ml離心管中，于2500 rpm離心5 min。（2）棄上清，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm離心5 min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。（3）用槍洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細胞充分裂解。（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 三、蛋白含量的測定 1. 制作標準曲線（1）從－20℃取出1 mg/ml BSA，室溫融化后，備用。（2）取18個1.5 ml離心管，3個一組，分別標記為0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。（3）按下表在各管中加入各種試劑。（4）混勻后，室溫放置2 min。在生物分光光度計（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。 2. 檢測樣品蛋白含量（1）取足量的1.5 ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍溶液1 ml。室溫放置30 min后即可用于測蛋白。（2）取一管考馬斯亮藍加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標準曲線的程序下按blank測空白樣品。（3）棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用無菌水洗一次。（4）取一管考馬斯亮藍加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待測蛋白樣品，混勻后靜置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次。可同時混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時間。測得的結(jié)果是5 ml樣品含的蛋白量。重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 四、SDS－PAGE電泳 1. 清洗玻璃板一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。 2. 灌膠與上樣（1）玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。（操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）（2）按前面方法配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10 ml槍吸取5 ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。）（3）當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。（4）按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。（5）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）（6）測完蛋白含量后，計算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 ml離心管中，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15 μl，加樣孔的最大限度可加20 μl樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。（7）加足夠的電泳液后開始準備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。）用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。 3. 電泳電泳時間一般4～5 h，電壓為40 V較好，也可用60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 五、轉(zhuǎn)膜 1. 轉(zhuǎn)一張膜需準備6張7.0～8.3 cm的濾紙和1張7.3～8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水。 2. 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。 3. 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。 4. 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。（撬時一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通。） 5. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h。 6. 轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 六、免疫反應(yīng) 1 . 將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。 2. 將一抗用TBST稀釋至適當濃度（在1.5 ml離心管中）；撕下適當大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。 3. 同上方法準備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 七、化學(xué)發(fā)光，顯影，定影 1. 將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。 2. 在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當大小（比膜的長和寬均需大1 cm）；打開X-光片夾，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關(guān)上X-光片夾，開始計時；根據(jù)信號的強弱適當調(diào)整曝光時間，一般為1 min或5 min，也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為1～2 min（20～25℃），溫度過低時（低于16℃）需適當延長顯影時間；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間一般為5～10 min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結(jié)果產(chǎn)生影響。重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 八、凝膠圖象分析將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。 Recombinant rat Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type IV 重組大鼠鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IV型 Recombinant human Calpain-1 catalytic subunit 重組人鈣蛋白酶-1催化亞基 Recombinant mouse Calpain-1 catalytic subunit 重組小鼠鈣蛋白酶-1催化亞基 Recombinant human Calpain-2 catalytic subunit 重組人鈣蛋白酶2催化亞基 Recombinant pig Calpain-2 catalytic subunit 重組豬鈣蛋白酶2催化亞基 Recombinant human Calpain small subunit 1 重組人鈣蛋白酶小亞基1 Recombinant human F-actin-capping protein subunit alpha-2 重組人F-肌動蛋白封蓋蛋白亞基的α-2 Recombinant human Caspase-14 protein 重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-2 重組人caspase-2 Recombinant human Caspase-5 重組人caspase-5 Recombinant human Extracellular calcium-sensing receptor 重組人細胞外鈣敏感受體 Recombinant human Calpastatin 重組人鈣蛋白酶抑制蛋白 Recombinant Human Cystathionine beta-synthase 重組人胱硫醚β-內(nèi)合酶 Recombinant Human Cystathionine beta-synthase 重組人胱硫醚β-內(nèi)合酶 Recombinant Human Chromobox protein homolog 7 重組人蛋白Chromobox 7同源 Recombinant human C-C motif chemokine 16 重組人C-C圖案趨化因子16 Recombinant Macaca mulatta Chemokine CCL20/MIP-3ALPHA 重組獼猴趨化因子CCL20 / MIP-3ALPHA Recombinant human C-C motif chemokine 21 重組人C-C圖案趨化因子21 Recombinant Human C-C motif chemokine 25 重組人C-C圖案趨化因子25 Recombinant Human C-C motif chemokine 8 重組人C-C圖案趨化因子8 Recombinant human G1/S-specific cyclin-D1 重組人G1 / S期特異性細胞周期蛋白D1的 Recombinant human T-complex protein 1 subunit beta 重組人T-復(fù)合蛋白1亞基的β Recombinant human Monocyte differentiation antigen CD14 重組人單核細胞分化抗原CD14 Recombinant Human Antigen-presenting glycoprotein CD1d 重組人抗原呈遞糖蛋白的CD1d Recombinant human T-cell surface antigen CD2 重組人T細胞表面抗原CD2 Recombinant Rabbit CD40 ligand 重組兔CD40配體 Recombinant human CD44 antigen 重組人CD44抗原 Recombinant mouse Membrane cofactor protein 重組小鼠膜輔助因子蛋白 Recombinant human CD59 glycoprotein 重組人CD59糖蛋白 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重組人C型凝集素域家族成員18一 Recombinant mouse Clathrin light chain A 重組小鼠網(wǎng)格蛋白輕鏈 Recombinant Human Clathrin heavy chain 2 重組人網(wǎng)格蛋白重鏈2 Recombinant dog Chymase 重組狗糜蛋白酶 Recombinant mouse Chymase 重組小鼠糜蛋白酶 Recombinant human Cellular nucleic acid-binding protein 重組人細胞核酸結(jié)合蛋白質(zhì) Recombinant human Calponin-1 重組人鈣調(diào)節(jié)蛋白-1 Recombinant Human Calponin-3 重組人調(diào)寧蛋白-3 Recombinant human Contactin-associated protein 1 重組人Contactin相關(guān)蛋白1 Recombinant human Collagen alpha-1(XI) chain 重組人膠原α-1（XI）鏈 Recombinant Gallus gallus Collagen alpha-1(XII) chain 重組雞內(nèi)金膠原α-1（十二）鏈 Recombinant human Collagen alpha-1(IV) chain 重組人膠原α-1（IV）鏈

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