檢測認證人脈交流通訊錄
- 一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預包被偶聯抗原,樣本中的殘留物鏈霉素將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗鏈霉素抗體,加入酶標記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物鏈霉素的含量成負相關,與標準曲線比較即可得出相應殘留物鏈霉素的含量。
二、試劑盒特性
試劑盒靈敏度: 0.5ppb
樣本檢測下限
雞肉、雞肝、牛奶—————————————20ppb
蜂 蜜/蜂王漿— —— — —— — —— —————10ppb
交叉反應率
鏈霉素 — — —— —— — — — — —— — — 100%
雙氫鏈霉素 ——————— —— — — —— —108%
卡拉霉素 —— — — — — — — — — — — — — < 1%
慶大霉素 — — —— — — — — — — — —— — < 1%
回收率
牛 奶— —— —— —— —— —— —— —95±15%
雞肉組織— —— —— —— —— —— —— —85±10%
蜂蜜/蜂王漿 — —— —— —— —— —— —75±15%
三、試劑盒組成
1、 微量測試孔:每條8孔,一板12條
2、 標準液×6瓶:(1ml/瓶)0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
3、 酶標記物 7ml ……………… 紅色帽
4、 抗體工作液 7ml ……………… 藍色帽
5、 底物液 A液 7ml ……………… 白色帽
6、 底物液 B液 7ml ……………… 黑色帽
7、 終止液 7ml ……………… 黃色帽
8、20×濃縮洗滌液 40ml ……………… 白明帽
9、10×濃縮復溶液 50ml ……………… 透明帽
四、所用儀器、試劑
具備的儀器:微孔板、酶標儀、勻質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平(感量0.01g)
微量移液器:單道 20ul~200ul、100ul~1000ul多道 250 ul
試 劑:濃磷酸、氫氧化鈉、Na2HPO4?12H2O、NaH2PO4?2H2O、正己烷
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時,都必須注意:
(a)實驗中必須使用一次性吸頭,在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
(b)實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,必要時可對實驗器具進行清潔,以避免污染干擾實驗結果。
樣本前處理需配制:
配液1、將濃縮復溶液用去離子水按1:9稀釋(1份濃縮復溶液+9份去離子水)。
配液2、0.05M PB溶液
13.0gNa2HPO4?12H2O+2.2gNaH2PO4?2H2O加去離子水定溶至1L。
配液3、0.04M磷酸溶液
1ml濃磷酸加去離子水定溶至360ml。
配液4、1M NaOH溶液
稱取4g NaOH加去離子水定溶至100ml。
(a)牛奶樣本的處理方法
1、 取牛奶1ml,按1:39稀釋,混合30s。(50 ul牛奶+1950 ul稀釋后的復溶液)
2、 取50ul用于分析。
稀釋倍數:40
(b)雞肉、雞肝樣本的處理方法
1、 取2±0.05g去除脂肪的勻漿樣本與8ml 0.05MPB緩沖液混合5min,置56℃水浴環境放置30min;
2、 室溫4000r/min以上,離心10min;
3、 取1ml上清液加入1ml正己烷,充分混勻,室溫4000r/min以上,離心5min
4、 去上層液體取50ul下層液,加入450ul 稀釋后的復溶液混勻,混合30s;
5、 取50ul用于分析。
樣本稀釋倍數:40
(c)蜂蜜、蜂王漿:
1、 稱量2±0.05g 樣本加入4ml 0.04M磷酸,振蕩至完全溶解,
2、 室溫4000r/min以上,離心5min,直至清亮。(蜂蜜樣本可不用離心直接進行第3步)
3、 加入450ul 1M NaOH將PH值調至7-9之間.(蜂王漿樣本需將全部上清移至另一干凈離心管中調節PH值至7-9之間)
4、 室溫4000r/min以上,離心5min ,直至清亮。
5、 取50ul上清液,加入450ul稀釋后的復溶液混勻,混合30s;
6、 取50ul用于分析。
稀釋倍數:20 檢測下限:10ppb
六、 酶標免疫分析程序:
測定前應須知:
1、 使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫(20-25℃)。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、 在ELISA分析中的再現性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、 在所有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。
操作步驟:
1、 從4℃冷藏環境中取出所需試劑,置室溫(20-25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出需要數量的微孔及框架,將不用的微孔放入自封袋,保存于2-8℃。
3、 配液:將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照1:19稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號:將樣本和標準品對應微孔按序編號,每個樣本和標準品做2孔平行,并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標準品/樣本50μl /孔,然后加酶標記物50μl/孔,再加入抗體工作液50μl/孔。輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板,37℃環境反應40min。
6、 取出用洗滌液按每孔250ul,洗板4-5次,每次浸泡15-30秒,拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
7、 顯色:每孔加入底物A液50ul,再加底物B液50ul,輕輕振蕩混勻,37℃環境中避光顯色20min。
8、 測定:每孔加入終止液50μl,輕輕振蕩混勻,設定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,在5min內讀完數據),測定每孔OD值。
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