方案優(yōu)勢(shì)

采用 固相萃取技術(shù)富集、凈化，采用高效 液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)各類 食品樣品中的12 種添加劑，并對(duì)各試 驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，本方法快捷、準(zhǔn)確、 靈敏度高， 適用于各類食品樣品中添 加劑的測(cè)定。

采用標(biāo)準(zhǔn)

相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)

方法/原理/步驟

　　樣品處理

　　液體樣品

　　稱取液體樣品10 mL于100 mL離心管中，加入0.2 mL甲酸，渦旋混勻1分鐘后，超聲提取10分鐘，離心，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，取5 mL上已活化的Oasis WAX柱，依次以10 mL 2%甲酸淋洗，5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，氮吹濃縮到1 mL進(jìn)樣。

　　固體樣品

　　稱取固體樣品2 g于100 mL離心管中，加入25 mL乙醇:氨水:水(9:0.5:0.5)混合溶劑勻漿，渦旋1分鐘后超聲提取30分鐘，離心，殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并提取液旋蒸定容10mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，取5 mL上已活化的Oasis WAX柱，依次以10mL 2%甲酸淋洗，5mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，氮吹濃縮到1 mL進(jìn)樣。

　　結(jié)果與分析

　　前處理的選擇

　　樣品基質(zhì)復(fù)雜，而且同時(shí)檢測(cè)12種添加劑并保證準(zhǔn)確和高的回收率，這對(duì)前處理提出了很高的要求。幾種添加劑均可溶于水因此文獻(xiàn)往往采用直接濾膜過濾后檢測(cè)，但對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，極易造成系統(tǒng)的污染。選擇合適的前處理方法，可以去除雜質(zhì)，降低基線雜質(zhì)噪音。文獻(xiàn)中前處理的步驟往往繁瑣耗時(shí)、回收率偏低，從添加劑自身化合物性質(zhì)出發(fā)，結(jié)合文獻(xiàn)設(shè)計(jì)了樣品前處理方法。

　　1.沉淀劑

　　部分固體樣品中含有蛋白質(zhì)，如果蛋白沉淀劑選擇不當(dāng)，將對(duì)后期實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、乙酸鋅-亞鐵氰化鉀去除蛋白，但這一過程中部分防腐劑、色素也被沉淀吸附，降低回收率。作者采用氨水:乙醇:水溶液進(jìn)行提取。糖精鈉、苯甲酸和山梨酸在堿性條件下以鹽的形式存在，可以溶于強(qiáng)極性的溶劑。安賽蜜易電離，合成色素是水溶性化合物，易溶于水及極性溶液；濃度90%以上的乙醇又可以使蛋白質(zhì)脫水，促進(jìn)蛋白質(zhì)的凝聚，同時(shí)乙醇可起到破壞沉淀膠體減少干擾的作用。通過對(duì)不同比例的氨水乙醇水溶液進(jìn)行比較，最終確定實(shí)驗(yàn)比例。

　　2.固相萃取柱

　　提取液可同時(shí)將糖和某些脂溶性成分提取出，影響基線穩(wěn)定性并形成雜質(zhì)干擾。所以選取固相萃取小柱進(jìn)行凈化。

　　根據(jù)文獻(xiàn)試驗(yàn)考察了不同分離模式的固相萃取柱，包括：反相C18-HLB固相萃取柱)和弱陰離子交換WAX柱固相萃取柱、強(qiáng)陰離子交換MAX固相萃取柱。

　　HLB柱以親水一親脂共聚物吸附劑為固定相，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HLB柱對(duì)安賽蜜、糖精鈉和胭脂紅、赤蘚紅回收率較低，尤其赤蘚紅僅在20%左右。所以試驗(yàn)又對(duì)其他小柱進(jìn)行了考察，強(qiáng)陰離子交換MAX無法保留糖精鈉、安賽蜜、苯甲酸、山梨酸，實(shí)驗(yàn)中，糖精鈉、安賽蜜、苯甲酸、山梨酸回收率僅為35%，可能當(dāng)pH為8～9時(shí)，這四種物質(zhì)的分子狀態(tài)不穩(wěn)定，無法保留在MAX柱上。

　　Oasis WAX屬于混合型弱陰離子交換反相吸附柱，可以有效地去除雜質(zhì)干擾，提高回收率。幾種甜味劑和防腐劑同時(shí)帶有有機(jī)官能團(tuán)和可離子化官能團(tuán)在中性和偏酸性條件下，電離效果降低，主要以中性分子的形式存在，利用反相柱的吸附作用形成保留。而赤蘚紅為苯甲酸鈉結(jié)構(gòu)，也存在一定保留，其他合成色素為苯磺酸鈉結(jié)構(gòu)含有磺酸基，屬強(qiáng)陰離子化合物，利用弱陰離子交換作用形成保留效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)赤蘚紅回收率偏低，可能是赤蘚紅的苯甲酸鈉結(jié)構(gòu)，相對(duì)其他苯磺酸鈉結(jié)構(gòu)的著色劑，保留較弱；其次甲醇及甲酸可對(duì)赤蘚紅部分洗脫，與小柱結(jié)合較弱的赤蘚紅也被部分洗脫；另外混合纖維素膜對(duì)赤蘚紅有較強(qiáng)吸附，常用的聚醚砜和尼龍濾膜對(duì)部分色素也有很強(qiáng)的吸附作用，最后采取0.45μm聚四氟乙烯濾膜過濾。

　　3.流動(dòng)相的選擇

　　實(shí)驗(yàn)選取純水和甲醇；乙腈-乙酸銨；甲醇-乙酸銨體系分別進(jìn)行考察。發(fā)現(xiàn)純水和甲醇流動(dòng)相無法使安賽蜜、苯甲酸和山梨酸有效分離。可能是因?yàn)橹行詶l件下，部分甜味劑和防腐劑以陰離子的形式存在，與色譜柱的固定相之間的作用較弱，分離效果差；在弱酸性流動(dòng)相中可使苯甲酸和山梨酸主要以中性分子形式存在，與固定相之間的相互作用顯著增強(qiáng)，分離效果得到明顯改善。試驗(yàn)表明，而合成色素的分離效果受pH值影響較小。

　　乙腈-乙酸銨體系無法使部分合成色素(如胭脂紅、日落黃)有效分離，而甲醇-乙酸銨各添加劑得到有效分離、峰形最佳。進(jìn)一步選用0.01 mol/L、0.02 mol/L、0.03 mol/L、0.04 mol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)在0.02 mol/L時(shí)各種添加劑的峰形和分離效果達(dá)到最佳；當(dāng)濃度再增大時(shí)，峰形和分離效果無明顯增強(qiáng)。這主要是因?yàn)槿跛嵝缘闹幸宜徜@緩沖鹽溶液含有羧酸基團(tuán)可對(duì)甜味劑和防腐劑有更強(qiáng)的洗脫能力，因此最終選用0.02 mol/L甲醇-乙酸銨流動(dòng)相體系。

　　檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

　　檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅、誘惑紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)8種合成色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有苯磺酸基，有較強(qiáng)的紫外吸收特性。同時(shí)各種色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中所含的發(fā)色團(tuán)及助色團(tuán)不同而呈現(xiàn)不同的顏色，在可見光區(qū)也有各自的較強(qiáng)的吸收。標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用紫外光譜儀進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在210 nm附近處有較大吸收峰，但由于樣品中很多干擾物在此波長(zhǎng)下都有吸收，因此優(yōu)先選擇可見波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，最后確定為：檸檬黃428 nm、莧菜紅521 nm、日落黃483 nm、胭脂紅509 nm、亮藍(lán)630nm、靛藍(lán)608 nm、胭脂紅509 nm、誘惑紅和赤蘚紅波長(zhǎng)530 nm。GB/T5009.35-2003第一法選擇254 nm波長(zhǎng)檢測(cè)，其他色素可以很容易的檢出，只有亮藍(lán)靈敏度很低，選擇可見光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)檢測(cè)后亮藍(lán)和赤蘚紅的靈敏度明顯提高并且干擾物影響小。

　　對(duì)甜味劑和防腐劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外掃描發(fā)現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)分別為：安賽蜜226 nm，糖精鈉202 nm，苯甲酸224 nm，山梨酸253 nm。由于流動(dòng)相在低于200 nm下有吸收，會(huì)造成噪音過高，250 nm處苯甲酸、糖精鈉靈敏度太低不能滿足檢測(cè)需要，為此選230 nm為苯甲酸、山梨酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。安賽蜜、糖精鈉的最大吸收波長(zhǎng)分別在226 nm及202 nm處，本實(shí)驗(yàn)選用作為檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)合文獻(xiàn)作者選取靈敏度相近的214nm處進(jìn)行檢測(cè)。

　　干擾試驗(yàn)

　　在實(shí)際樣品檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，某些食品基質(zhì)中可以對(duì)安賽蜜與糖精鈉的測(cè)定造成干擾。如酒類產(chǎn)品中的糠醇等存在與糖精鈉接近的化學(xué)結(jié)構(gòu)，保留時(shí)間與吸收光譜均類似，易造成假陽性判定。建議進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)或輔助進(jìn)行光譜掃描或串聯(lián)熒光檢測(cè)器，進(jìn)行驗(yàn)證。

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

　　將12種標(biāo)準(zhǔn)品用水配制成濃度分別為：0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析，得到色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

　　回收率的分析

　　取5種不同類型食品，分別用本方法制成樣品溶液，分別加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使標(biāo)品濃度分別為0.02mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.80mg/mL、0.10 mg/mL，按1.5樣品前處理方法進(jìn)行處理后檢測(cè)，可以滿足檢測(cè)要求。

儀器設(shè)備

　　主要儀器與設(shè)備

　　Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；超聲波清洗儀(上海聲彥超聲波儀器有限公司)；旋渦混合器(國力天科技有限公司)；固相萃取小柱(WatersOasis WAX，預(yù)先經(jīng)5 mL甲醇、5 mL水、5mL2%的甲酸水溶液活化)。

　　色譜條件

　　色譜柱：CNW Athena C18-WP (4.6×250 mm，5μm)；柱溫：20.0℃；流動(dòng)相：A：甲醇，B：乙酸銨溶液(0.02mol/L+5%甲醇)，梯度洗脫見表1；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10μL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：檸檬黃428 nm、莧菜紅521 nm、日落黃483 nm、胭脂紅509 nm、亮藍(lán)630nm、靛藍(lán)608 nm、胭脂紅509 nm、誘惑紅和赤蘚紅波長(zhǎng)530 nm、山梨酸和苯甲酸230 nm、糖精鈉和安賽蜜214nm。