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人腸道病毒71型（EV71）定性檢測試劑盒（ELISA）說明書

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【產品名稱】通用名稱：人腸道病毒71型（EV71）定性檢測試劑盒（ELISA）英文名稱：Human EV71 （EV71） ELISA KIT 【包裝規格】 48人份/盒，96人份/盒【預期用途】僅供科研使用，定性檢測血清、血漿、細胞培養上清液中是否含有人腸道病毒71型。【檢驗原理】本試劑盒采用間接法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。在預包被人腸道病毒71型抗原（固相抗原，貨號：INS1070001C）的微孔酶標板中，加入人腸道病毒71型陰陽性性對照（貨號：INS1070001J）和待測樣本，溫育洗滌，再加入另一株HRP標記的抗人腸道病毒71型抗體（酶標抗體，貨號：INS1070001E），經過溫育與充分洗滌，去除未結合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗原-抗體-酶標抗體的夾心復合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產生藍色產物，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉化為黃色，在酶標儀上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中人腸道病毒71型的濃度正相關，通過計算公式判斷樣品陰陽性。【主要組成成分】主要成分組分數量主要成分陰性對照 0.5ml/管不含待測物的緩沖液陽性對照 0.5ml/管含待測物的緩沖液包被微孔板 96T 預包被固相抗原 HRP標記抗體 6mL HRP標記的檢測抗體底物液A 6mL 過氧化脲工作液底物液B 6mL TMB工作液樣本稀釋液 6mL 緩沖液終止液 6mL 硫酸稀釋液 20×濃縮洗滌液 30mL 含0.15%Tween20的PBS 說明書 1份 -- 自封袋 1個 -- 不干膠 2片 -- 陰陽性對照已經通過測試，結果表明HBs抗原陰性，HIV1、HIV2和HCV抗體陰性，由于不存在一種試驗方法能夠完全保證沒有這些物質，本品必須按照具有潛在的感染性進行處理，處理過程應當遵循通用的安全措施。需要但未提供的材料及耗材 1、酶標儀 2、精密移液器及一次性吸頭 3、蒸餾水 4、洗瓶或者自動洗板機 5、37℃水浴鍋或恒溫箱 6、500ml量筒 7、無粉一次性乳膠手套 8、質控品（可以從藍圖生物選擇，貨號：INS1070001Q）【儲存條件及有效期】 1、2-8℃保存，切勿冷凍，有效期6個月。 2、開封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋，并將全部試劑放回2-8℃冰箱。 3、開封后，按照建議的條件保存，校準品、包被微孔板和HRP標記抗體，有效期為28天，其他成分在標簽標明的有效期內是穩定的。【適用儀器】半自動的酶標儀，如Thermo MK3，或者國產酶標儀。【樣本要求】樣本類型和采集以下只是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。 1、細胞培養上清：4000rpm條件下離心20min，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復凍融。 2、血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在- 20℃以下，避免反復凍融。 3、血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復凍融。樣本保存和穩定性樣本在2-8℃條件下，可以儲存72h，或者在- 20℃儲存6個月。樣本收集后，不是一次檢測完，請按一次用量分裝凍存，避免反復凍融，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。【檢驗方法】試劑準備 1、使用前，所有的組分都要至少復溫2h，確保充分復溫到室溫。 2、濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會有結晶產生，這屬于正常現象，水浴加熱使結晶完全溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。 3、底物：底物液A和B，在使用前，按1:1體積充分混合，混合后15分鐘內使用。操作程序 1、所有試劑和組分都先恢復到室溫，標準品、質控品和樣品，建議做復孔。 2、按前面試劑準備中描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。 3、從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。 4、設置陰陽性對照孔、樣本孔，陰陽性對照孔各加對照品50μL，樣本孔加樣本50μL。 5、用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。 6、揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置20s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復4次（共洗板5次）。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進行洗板，添加浸泡20s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應板。 7、所有孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100μL。 8、用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。 8、揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置20s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復4次（共洗板5次）。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進行洗板，添加浸泡20s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應板。 9、將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。 10、所有孔加入終止液50μL，在酶標儀上讀取各孔吸光度（OD值）。【檢驗結果的解釋】檢測完成后，以陰性對照的OD+0.25，做為閾值，樣本OD值大于閾值，為陽性；樣本OD值低于閾值為陰性。【檢驗方法的局限性】 1、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。 2、在試劑盒標示的有效期內使用，過期產品不得使用。 3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。 4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。 5、如果樣本值高于最高標準品濃度值，請將樣本適當稀釋后，再重新測定。 6、待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結果，檢測前，請排除該因素。 7、通過其他方法得到的檢測結果，與本試劑盒測定結果不具有直接的可比性。【產品性能指標】 1、物理性能試劑盒的各液體組分應澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝，無破損漏氣。 2、陰性結果陰性對照的OD值不高于0.2。 3、陽性結果陽性對照的OD值不低于0.8。 4、特異性本試劑盒識別天然和重組人腸道病毒71型，與結構類似物無交叉。 5、穩定性 2℃-8℃保存，有效期6個月。【注意事項】生物安全 1、檢測必須符合實驗室管理規范的規定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。 2、試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應，避免吸入煙霧與皮膚接觸。 3、底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。戴上防護手套，實驗完成后徹底洗手。技術提示 1、混合蛋白溶液時，避免起泡。 2、加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。 3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結果準確性的必要條件。 4、底物溶液為無色液體，保存過程中變為藍色，代表底物溶液已經失效，不得使用。 5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產物，會瞬間變為黃色。 6、實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。 7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。廢物處理所有使用或未使用的試劑，所有污染性的一次性材料，應當遵循傳染性或潛在傳染性產品的處理程序，每個實驗室都有責任根據其實驗的類型和危險性級別，進行廢物和污物的處理，同時要嚴格依照有關規定對待所有的廢物和污物

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